1. Slimības ierosinātāja identificēšana
1. Ja aborta materiālā, vaginālajos izdalījumos vai pienā, izmantojot modificētu ātrdarbīgu skābi vai imunospecifisku organismu iekrāsošanos, konstatē Brucella spp. morfoloģiju, tad rodas aizdomas par dzīvnieka saslimšanu ar brucelozi, īpaši, ja to apstiprina ar seroloģiskajām izmeklēšanas metodēm. Par papildu metodi cūku brucelozes ierosinātāja noteikšanai var izmantot polimerāzes ķēdes reakciju.
2. Ja iespējams, Brucella spp. izdala, izmantojot vienkāršu vai selektīvu barotni ar kultivēšanu no dzemdes izdalījumiem, abortētiem augļiem, tesmeņa sekrētiem vai citiem atlasītiem audiem, piemēram, limfmezgliem, sievišķiem un vīrišķiem reproduktīviem orgāniem.
3. Pēc izdalīšanas Brucella spp. sugas un bioloģisko variantu nosaka ar fāgu līzi vai oksidatīvā metabolisma pārbaudi pēc kultivēšanas, bioķīmiskajiem un seroloģiskajiem kritērijiem. Polimerāzes ķēdes reakcija ir metode, kas dod iespēju noteikt biotipu, pamatojoties uz īpašām ģenētiskām kombinācijām.
4. Izmantoto laboratorisko metožu un barotņu standartizēšanu un rezultātu interpretāciju veic saskaņā ar Pasaules Dzīvnieku veselības organizācijas (turpmāk – OIE) Sauszemes dzīvnieku slimību diagnostikas testu un vakcīnu rokasgrāmatu, kuras aktuālā versija latviešu valodā par cūku brucelozi ir pieejama valsts zinātniskā institūta "Pārtikas drošības, dzīvnieku veselības un vides zinātniskais institūts "BIOR"" tīmekļa vietnē.
2. Imunoloģiskās metodes
2.1. References materiāli
5. Visu to antigēnu sagatavošanai, kurus izmanto asins seruma parauga izmeklēšanā ar Roz-Bengala reakciju (turpmāk – RBR metode), aglutinācijas reakciju (turpmāk – AR metode) un komplementa saistīšanas reakciju (turpmāk – KSR metode), lieto Brucella abortus biovaru 1, Veibridžas celmu 99 vai USDA celmu 1119-3.
6. References standartserums RBR metodē, AR metodē un KSR metodē ir OIE starptautiskais references standartserums (turpmāk – OIEISS).
7. OIEISS ir starptautiskais primārais standartserums, pēc kura valsts references laboratorija ar šā pielikuma 5.punktā minētajām metodēm nosaka valsts sekundāro references standartserumu (turpmāk – darba standartserums).
2.2. Komplementa saistīšanas reakcija
8. Antigēns ir baktēriju suspensija fenola sāls šķīdumā (0,85 % NaCl (m/v) un 0,5 % fenola (v/v)) vai veronāla buferšķīdumā. Antigēnus var piegādāt koncentrētā formā, ja uz iepakojuma etiķetes norāda lietojamo atšķaidījuma koeficientu. Antigēnu uzglabā 4 °C temperatūrā nesasaldētu.
9. Cūku asins serumu inaktivē 30 līdz 50 minūtes 60 °C temperatūrā.
10. Lai veiktu reakciju saskaņā ar KSR metodi, izmanto komplementa devu, kas pārsniedz pilnīgai hemolīzei nepieciešamo devu.
11. Izmantojot KSR metodi, katru reizi veic šādas kontroles:
11.1. asins seruma antikomplementārās iedarbības kontroli;
11.2. antigēna kontroli;
11.3. sensitivizēto sarkano asinsķermenīšu kontroli;
11.4. komplementa kontroli;
11.5. jutības kontroli, reakcijas sākumā izmantojot pozitīvu serumu;
11.6. reakcijas specifiskuma kontroli, izmantojot negatīvu serumu.
12. OIEISS satur 1000 starptautisko specifisko antivielu vienību (turpmāk – ICFTU) mililitrā.
13. Ja OIEISS pārbauda ar KSR metodi, rezultātu izsaka kā titru (t.i., lielākais tiešais OIEISS atšķaidījums, kas dod 50 % hemolīzi, TOIEISS). Ar KSR metodi iegūtais rezultāts asins seruma paraugā, kas izteikts kā titrs (TTESTSERUM), izsaka ICFTU mililitrā. Lai pārveidotu titra izteiksmi ICFTU, koeficientu (F), kas nepieciešams, lai pārvērstu ICFTU izteiksmē nezināma KSR asins seruma titru (TTESTSERUM), kas pārbaudīts ar šo metodi, var aprēķināt, izmantojot šādu formulu:
F = 1000 x 1/TOIEISS
Starptautisko specifisko antivielu vienību saturu asins seruma paraugā mililitrā (ICFTUTESTSERUM) var aprēķināt, izmantojot šādu formulu:
ICFTUTESTSERUM = F x TTESTSERUM
14. Ar KSR metodi iegūto rezultātu interpretēšana – izmeklējumu rezultātu uzskata par pozitīvu, ja asins seruma paraugā vienā mililitrā konstatē vismaz 20 vai vairāk ICFTU pret cūku brucelozes ierosinātāju.
2.3. Roz-Bengala reakcija
15. Antigēns ir baktēriju suspensija buferšķīdumā ar pH 3,65 ± 0,05, kas iekrāsota, izmantojot Roz-Bengala krāsvielu. Antigēnu piegādā gatavu lietošanai un uzglabā 4 °C temperatūrā nesasaldētu.
16. Antigēnu sagatavo, neņemot vērā šūnu koncentrāciju, bet tā jutību standartizē attiecībā pret OIEISS tā, lai antigēns dotu pozitīvu reakciju asins seruma atšķaidījumā 1 : 45 un negatīvu reakciju – atšķaidījumā 1 : 55.
17. RBR metodes izmantošanas nosacījumi:
17.1. asins serumu (20–30 μl) samaisa ar tādu pašu daudzumu antigēna uz baltas plāksnītes vai emaljas plātnes, lai rastos zona aptuveni 2 cm diametrā. Maisījumu četras minūtes viegli krata apkārtējās vides temperatūrā un tad apskata labā apgaismojumā, lai noteiktu aglutināciju;
17.2. automātisko metodi var izmantot, bet tai jābūt vismaz tikpat jutīgai un precīzai kā manuālajai metodei.
18. Ar RBR metodi iegūto rezultātu interpretēšana – jebkuru redzamu reakciju atzīst par pozitīvu, ja vien malās nav vērojama pārmērīga izžūšana. Pozitīvos un negatīvos darba standartserumus izmanto katrā izmeklēšanas reizē ar RBR metodi.
2.4. Aglutinācijas reakcija
19. Antigēns ir baktēriju suspensija fenola sāls šķīdumā (0,85 % NaCl (m/v) un 0,5 % fenola (v/v)). Nedrīkst izmantot formaldehīdu. Antigēnus var piegādāt koncentrētā formā, ja uz pudeles etiķetes norāda lietojamo atšķaidījuma koeficientu. Izmeklējot asins seruma paraugu ar AR metodi, antigēna suspensijai var pievienot EDTA līdz 5 mM beigu atšķaidījumam, lai samazinātu kļūdainu pozitīvo rezultātu risku. Antigēna suspensijai pielāgo pH 7,2.
20. OIEISS satur 1000 starptautisko aglutinācijas vienību.
21. Antigēnu sagatavo, neņemot vērā baktēriju šūnu koncentrāciju, bet tā jutību standartizē attiecībā pret OIEISS tā, lai antigēns dotu vai nu 50 % aglutināciju ar gala asins seruma atšķaidījumu 1 : 600 līdz 1 : 1000, vai 75 % aglutināciju ar gala asins seruma atšķaidījumu 1 : 500 līdz 1 : 750. Iesaka salīdzināt jaunu un iepriekš standartizētu antigēnu reaģētspēju, izmantojot noteiktu serumu grupu.
22. Izmeklēšanu ar AR metodi veic mēģenēs vai mikroplatēs. Antigēna un asins seruma atšķaidījuma maisījumu inkubē 16 līdz 24 stundas 37 °C temperatūrā. Katram asins serumam sagatavo vismaz trīs atšķaidījumus. Aizdomīgā asins seruma atšķaidījumus sagatavo tā, lai reakciju pozitivitātes robežās varētu nolasīt vidējā mēģenē (vai vidējā padziļinājumā, ja izmanto mikroplates metodi).
23. Ar AR metodi iegūto rezultātu interpretācija – aglutinācijas līmeni asins serumā izsaka starptautiskajās vienībās mililitrā (turpmāk – IU/ml). Izmeklējumu rezultātu uzskata par pozitīvu, ja asins seruma paraugā konstatē vismaz 30 vai vairāk IU/ml pret cūku brucelozes ierosinātāju.
3. Valsts references laboratorijas uzdevumi un pienākumi
24. Valsts references laboratorijas ir atbildīgas par:
24.1. to pētījumu rezultātu apstiprināšanu, kuri apliecina dalībvalstī izmantotās laboratoriskās metodes ticamību;
24.2. darba standartseruma kalibrēšanu attiecībā pret primāro starptautisko standartserumu, kas minēts šā pielikuma 2.1.apakšnodaļā;
24.3. visu antigēnu kvalitātes pārbaudēm;
24.4. sadarbību ar Eiropas Savienības dalībvalstu references laboratorijām saistībā ar brucelozes diagnostiku.
1. Vārds un uzvārds vai juridiskas personas nosaukums (drukātiem burtiem) _________________________________________________
_______________________________________________________________________________________________________________
2. Fiziskās personas deklarētās dzīvesvietas adrese vai juridiskās personas juridiskā adrese (drukātiem burtiem) _____________________
_______________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________________________________
3. Kontaktinformācija:
3.1. tālruņa vai mobilā tālruņa numurs _________________________________________________________________________________
3.2. faksa numurs _________________________________________________________________________________________________
3.3. e-pasta adrese ________________________________________________________________________________________________
4. Uzņēmuma reģistrācijas numurs komercreģistrā vai Uzņēmumu reģistrā
L |
V |
5. Ganāmpulka reģistrācijas numurs Lauku atbalsta dienesta reģistrā
L |
V |
6. Novietnes reģistrācijas numurs Lauku atbalsta dienesta reģistrā1
L |
V |
7. Novietnes faktiskās atrašanās vietas adrese, kas paredzēta statusa piešķiršanai ______________________________________________
_______________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________________________________
8. Novietnē:
8.1. dzīvniekiem pēdējo deviņu mēnešu laikā __________ novērotas brucelozes klīniskās pazīmes
(ir/nav)
8.2. tiek turēti šādi dzīvnieki (norādīt skaitu pa dzīvnieku grupām – vaislas kuiļi, sivēnmātes, vaislas jauncūkas, piena sivēni un nobarojamās cūkas) _________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________________________________
8.3. dzīvnieki seroloģiski izmeklēti pēdējo divu gadu laikā (testēšanas pārskata numurs)2
_______________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________________________________
______________________
(datums)3
(vārds, uzvārds) |
(paraksts)3 |
Piezīmes.
1 Norāda arī ganāmpulka īpašnieka vai turētāja piešķirto novietnes iekšējo numuru, ja tāds ir.
2 Pievieno testēšanas pārskatu kopijas.
3 Dokumenta rekvizītus "datums" un "paraksts" neaizpilda, ja elektroniskais dokuments sagatavots atbilstoši normatīvajiem aktiem par elektronisko dokumentu noformēšanu.
| Nr. p. k. | Sivēnmāšu skaits novietnē | Izmeklējamo sivēnmāšu kontroles paraugu skaits |
| 1. | 1–9 | visas |
| 2. | 10–19 | 10 |
| 3. | 20–29 | 16 |
| 4. | 30–39 | 19 |
| 5. | 40–49 | 21 |
| 6. | 50–59 | 22 |
| 7. | 60–69 | 23 |
| 8. | 70–79 | 24 |
| 9. | 80–89 | 24 |
| 10. | 90–99 | 25 |
| 11. | 100–119 | 25 |
| 12. | 120–139 | 26 |
| 13. | 140–159 | 26 |
| 14. | 160–179 | 27 |
| 15. | 180–199 | 27 |
| 16. | 200–249 | 27 |
| 17. | 250–299 | 27 |
| 18. | 300–349 | 28 |
| 19. | 350–399 | 28 |
| 20. | 400–449 | 28 |
| 21. | 450–499 | 28 |
| 22. | 500–599 | 28 |
| 23. | 600–699 | 28 |
| 24. | 700–799 | 28 |
| 25. | 800–899 | 28 |
| 26. | 900–999 | 28 |
| 27. | 1000–1199 | 29 |
| 28. | 1200–1399 | 29 |
| 29. | 1400–1599 | 29 |
| 30. | 1600–1799 | 29 |
| 31. | 1800–1999 | 29 |
| 32. | 2000–2999 | 29 |
| 33. | 3000–3999 | 29 |
| 34. | 4000–4999 | 29 |
| 35. | 5000–5999 | 29 |
| 36. | 6000–6999 | 29 |
| 37. | 7000–7999 | 29 |
| 38. | 8000–8999 | 29 |
| 39. | 9000–9999 | 29 |
| 40. | 10 000 | 29 |
